在生物醫學(xué)飛速發(fā)展的當下，多能干細胞的研究為神經(jīng)系統疾病的治療帶來(lái)了前所未有的曙光。其中，來(lái)自多能干細胞的神經(jīng)細胞藥物，正逐漸從實(shí)驗室的理論設想邁向臨床應用的現實(shí)。這一創(chuàng )新療法不僅有望重塑神經(jīng)系統疾病的治療格局，更可能為無(wú)數患者帶來(lái)新的希望。本文將深入探討這類(lèi)神經(jīng)細胞藥物從研發(fā)構思到臨床前評估的每一步歷程，剖析其背后復雜而精妙的科學(xué)進(jìn)程。

1.有關(guān)神經(jīng)系統疾病及干細胞治療神經(jīng)系統疾病的介紹

神經(jīng)系統是人類(lèi)各種認知和運動(dòng)功能的控制中心，神經(jīng)系統紊亂會(huì )導致嚴重的神經(jīng)系統疾病。近年來(lái)，神經(jīng)系統疾病已成為全球死亡和殘疾的一個(gè)重要原因，例如神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷，2016年分別影響了900萬(wàn)人和2.76億人。由于中樞神經(jīng)系統(?CNS?)的自我修復能力有限，針對中樞神經(jīng)系統疾病的治愈方法仍然很少。

長(cháng)期以來(lái)，細胞替代療法一直是治療神經(jīng)系統疾病的一種非常有前景的方法。胎兒腦源性神經(jīng)干細胞 (NSC) 和腹側中腦 (VM) 組織分別在治療中風(fēng)和帕金森病 (PD)?方面表現出積極作用。然而，由于倫理限制和細胞質(zhì)量的變化，胎兒組織的應用往往受到限制。人類(lèi)多能干細胞 (hPSC)，包括人類(lèi)胚胎干細胞 (hESC) 和人類(lèi)誘導多能干細胞 (hiPSC)，由于其無(wú)限的自我更新能力和向所需外胚層細胞類(lèi)型的多分化潛力，為移植提供了可行的神經(jīng)元細胞來(lái)源。到目前為止，幾種 hPSC 衍生的神經(jīng)元細胞類(lèi)型已在神經(jīng)系統疾病模型中成功測試，并已證明其體內安全性和有效性。一些國家還啟動(dòng)了首次人體臨床研究。

不過(guò)，細胞衍生物制備和質(zhì)量評估挑戰重重，涉及細胞類(lèi)型選擇、分化階段確定、動(dòng)物模型構建、質(zhì)量控制等多方面，這嚴重阻礙了干細胞臨床應用和商業(yè)化。

鑒于各國要求不同，監管政策有差異。國際干細胞銀行計劃匯聚研究人員，發(fā)表系列文件，就多能干細胞臨床轉化達成全球共識，涵蓋質(zhì)量控制、倫理等方面，推動(dòng)了轉化并保障細胞產(chǎn)品質(zhì)量安全，還與其他組織合作推進(jìn)細胞藥物制造標準化。

將多能干細胞轉化為神經(jīng)細胞藥物要經(jīng)過(guò)開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)和臨床前評估三大工序

在干細胞治療帕金森病領(lǐng)域，GForce-PD發(fā)揮國際協(xié)調作用。本文總結干細胞治療臨床前研究原則，為學(xué)術(shù)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)者提供指導，實(shí)際應用需遵循當地法規^[1]。

2.早期原則和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)

2.1 細胞獲取的倫理原則

• hESC和hiPSC依賴(lài)人類(lèi)捐獻者，獲取捐獻者細胞需遵循國際公認原則（如ISSCR 2016指南）與當地法律法規。
• 每個(gè)細胞系必須有捐獻者 / 主治醫生簽署的知情同意書(shū)，以及醫院的倫理支持文件。
• 要告知捐獻者隱私保護的限制，以滿(mǎn)足安全性和可追溯性需求。

2.2 細胞供體的選擇

• 需對胚胎或細胞捐獻者進(jìn)行仔細風(fēng)險評估，篩查各類(lèi)潛在人類(lèi)傳染性病原體，如 HIV、HBV、HCV 等嚴重血源性病毒性疾病。
• 根據捐獻者選擇過(guò)程中的信息，考慮篩查其他生物體。
• 專(zhuān)業(yè)評估還應考量遺傳病。
• 建議收集捐獻者血液樣本的ABO血型、HLAI類(lèi)和 II 類(lèi)基因型信息，用于檢查衍生細胞系身份，以及匹配細胞系血液和組織類(lèi)型，降低患者免疫反應。

2.3 適當的神經(jīng)細胞類(lèi)型

• 合適的細胞分化條件決定神經(jīng)元細胞多樣性，不同細胞表型特性和功能各異。
• 帕金森病由黑質(zhì)中腦多巴胺能神經(jīng)元（mDA）丟失引發(fā)，只有mDA細胞能在帕金森病模型中建立正確連接，獲得治療效果，前腦/后腦神經(jīng)元無(wú)效。
• 肌萎縮側索硬化癥（ALS）特征為上下運動(dòng)神經(jīng)元丟失，由反應性星形膠質(zhì)細胞毒性引起，除移植運動(dòng)神經(jīng)元，移植健康星形膠質(zhì)細胞改善微環(huán)境也是有效治療方法。
• 腦損傷、中風(fēng)和脊髓損傷等涉及多種神經(jīng)細胞功能喪失和微環(huán)境變化，使用單一神經(jīng)元細胞恢復連接有挑戰，神經(jīng)干細胞（NSC）能分化成神經(jīng)元且分泌神經(jīng)營(yíng)養因子，是有前途的治療細胞類(lèi)型。

2.4 移植細胞的階段

• 基于 hPSC 的神經(jīng)替代療法，移植階段的選擇很關(guān)鍵。
• 早期神經(jīng)祖細胞存活神經(jīng)元產(chǎn)量高，但有不受控制增殖風(fēng)險；成熟神經(jīng)元移植后存活率差。
• 移植細胞的存活情況和動(dòng)物模型行為改善可提示適當的移植階段。需找出不同階段（增殖祖細胞、有絲分裂后神經(jīng)母細胞、成熟神經(jīng)元）的特定標志物。
• 帕金森病細胞治療研究中，早期有絲分裂后神經(jīng)元應用最廣泛；星形膠質(zhì)細胞移植中，譜系限制性祖細胞應用廣泛，但各制造階段最佳細胞表型仍待進(jìn)一步研究。

3.細胞制造質(zhì)量控制的一般考慮因素

3.1 質(zhì)量管理體系

• 完善的質(zhì)量管理體系（QMS）對確保細胞庫運營(yíng)和細胞生產(chǎn)的可靠輸出極為關(guān)鍵，建議遵循適用于許可產(chǎn)品的良好生產(chǎn)規范（GMP）。
• QMS 需針對制造產(chǎn)品，明確制造商責任、采用標準及所有制造程序摘要，涵蓋捐贈者樣本收集、原材料選擇等一系列操作程序與質(zhì)量文件。
• QMS 要保證從原材料到最終產(chǎn)品的所有材料和程序具有可追溯性，通常在質(zhì)量手冊中闡述一般程序、相關(guān)標準和政策。

3.2 細胞株存庫流程

• 制備臨床細胞產(chǎn)品的首要步驟是確保建立 hPSC 的供體適用性，保存生產(chǎn)細胞的早期庫存，選擇符合 GMP 標準的科學(xué)質(zhì)量控制和安全測試線(xiàn)。
• 依據適用標準選擇和鑒定試劑及材料，如 “無(wú)異種” 和化學(xué)成分明確的培養基等。
• 為減少不同批次細胞差異，建議采用包含主細胞庫（MCB）和工作細胞庫（WCB）的多級細胞庫系統作為生產(chǎn)培養物供應起點(diǎn)。

3.3 hPSC 的質(zhì)量控制

• hPSC 作為起始材料，其質(zhì)量對確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量和可重復性意義重大。
• 需對細胞庫材料進(jìn)行適當的質(zhì)量控制檢測，包括細胞形態(tài)、活力、DNA 指紋等多項測試。
• hPSC 的批次間差異可能是工藝差異的主要來(lái)源，因此需開(kāi)發(fā)大量同一批次的 hPSC 。

3.4 產(chǎn)品過(guò)程管理

• 整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中，必須嚴格把控細胞產(chǎn)品質(zhì)量。質(zhì)量管理體系應在關(guān)鍵步驟指明特定的質(zhì)量控制測試，如細胞標志物和微生物測試，以保證提供具有特定傳代水平的可重復細胞制劑。
• hPSC 衍生產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程主要包括 hPSC 生產(chǎn)和神經(jīng)元細胞生產(chǎn)兩部分。hPSC 生產(chǎn)中，擴增時(shí)要進(jìn)行過(guò)程測試以確保其保持內在特性；神經(jīng)元細胞生產(chǎn)中，在分化過(guò)程的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行多項質(zhì)量控制測試，文中圖1總結了當前通用的已發(fā)布工作流程。

3.5 移植細胞的純度

• hPSC 神經(jīng)替代療法的關(guān)鍵挑戰是獲取高同質(zhì)性目標細胞類(lèi)型。需明確最終細胞產(chǎn)品全部組成并清除殘留干細胞，因其有安全風(fēng)險。
• 臨床證據顯示，污染的5-羥色胺神經(jīng)元可致PD患者移植物誘導的運動(dòng)障礙，臨床前研究表明殘留祖細胞會(huì )在腦或脊髓中異常增殖或形成結構。
• 部分研究團隊采用特定表面標志分選細胞、添加槲皮素等策略提高純度，且需驗證無(wú)未分化細胞。

3.6 細胞配制和保存

• 細胞作為“活藥物”，其生物過(guò)程持續進(jìn)行且受環(huán)境影響，建立有效保存制度很關(guān)鍵。
• 細胞制劑分新鮮非冷凍和冷凍保存兩類(lèi)。新鮮細胞活力和特性好但壽命短，不適合長(cháng)期儲存和全面質(zhì)控；冷凍細胞保質(zhì)期長(cháng)，可進(jìn)行質(zhì)控和安全放行測試，但凍融有損傷等問(wèn)題。
• 應選擇適合神經(jīng)元細胞的冷凍保存液，并驗證冷卻、解凍條件，且解凍后24小時(shí)細胞活力和恢復情況可準確反映冷凍效果，同時(shí)要按 ICH Q5C 指南研究細胞產(chǎn)品儲存和運輸穩定性。

3.7 細胞產(chǎn)品放行測試

• 細胞產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性是體內安全有效的前提，需對產(chǎn)品批次按預定比例測試。
• 評估系統包括生物污染、細胞活力等體外測試，應基于多批次數據制定放行測試公差。
• 基因組完整性檢測（如全基因組測序）有助于了解遺傳變異風(fēng)險，但要明確基因變化與患者安全相關(guān)性，雖無(wú)統一基因組穩定性標準，可參考已發(fā)表研究，選擇無(wú)癌癥相關(guān)基因大異?；蚍峭x突變細胞有助于降低致瘤風(fēng)險，但不能完全認證體內安全性。

4. 臨床前體內評估

4.1 細胞移植的部位

• 神經(jīng)元細胞移植旨在組織替代或提供局部營(yíng)養，需將細胞遞送至目標部位。例如中風(fēng)時(shí)在缺血半暗帶移植以拯救細胞和重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )；ALS 最佳途徑是鞘內注射；PD 治療可將細胞移植到背側紋狀體或黑質(zhì)。
• 嚙齒動(dòng)物一到兩個(gè)部位移植可實(shí)現神經(jīng)支配，靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物大腦較大，為實(shí)現足夠神經(jīng)支配，PD 臨床研究中每個(gè)半球常需三到八個(gè)注射道，非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物在移植策略評估上因大腦與人類(lèi)相似具有優(yōu)勢，小動(dòng)物移植策略不足以模擬人類(lèi)治療。

4.2 毒性試驗及劑量耐受性

• 界定細胞毒性和劑量耐受性對新藥至關(guān)重要。毒性測試應遵循臨床途徑，研究對靶器官及肝臟、心臟、腎臟等非靶器官的毒性作用。
• 高劑量細胞給藥安全風(fēng)險更大，動(dòng)物實(shí)驗中設置不同劑量組確定最大可行劑量可為臨床研究提供支持，當細胞在體內可能增殖時(shí)，劑量確定更具挑戰性，大鼠或小鼠腦內和脊髓接受細胞數量有一定范圍。

4.3 過(guò)度生長(cháng)和致瘤性檢測

• hPSC 衍生細胞安全性需考慮不受控制的增殖和腫瘤形成。過(guò)度細胞生長(cháng)會(huì )影響宿主細胞網(wǎng)絡(luò )和功能，要通過(guò)對足夠數量動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析研究移植物體積和增殖標志物，移植物體積與移植細胞性質(zhì)有關(guān)，如較年輕或分化程度低的細胞擴增更廣泛，純化神經(jīng)元制劑細胞損失和移植物尺寸減小。
• 要區分致癌性（宿主正常細胞受刺激形成腫瘤）和致瘤性（與移植細胞有關(guān)），為確定未分化 hPSC 污染情況，一些研究小組進(jìn)行加標研究。

4.4 體內存活和分布

• 神經(jīng)細胞移植期望在宿主體內長(cháng)期存活以替代丟失細胞，但因細胞消化、機械損傷和微環(huán)境改變等，大量移植細胞會(huì )死亡，移植 DA 存活率低，移植后第一周對細胞存活很關(guān)鍵，抑制 p53、改變聚唾液酸表達或注射 GDNF 有助于提高細胞存活率。
• 雖神經(jīng)元細胞長(cháng)距離遷移證據少，但需證明注射后細胞分布，非侵入性細胞追蹤方法可用于監測動(dòng)物，避免多個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物。

4.5 體內細胞命運

• 移植的神經(jīng)元細胞多由 NSC 和未成熟祖細胞組成，需在體內進(jìn)一步分化成熟。體外分化技術(shù)可靠，但體內復雜微環(huán)境會(huì )影響細胞命運造成異質(zhì)性，單細胞 RNA 測序顯示移植的多巴胺能祖細胞可產(chǎn)生多種細胞類(lèi)型，不同 NSC 系在脊髓產(chǎn)生神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的比例不同，因此確認細胞產(chǎn)物在體內轉化為所需細胞類(lèi)型及是否存在危險細胞類(lèi)型很重要。

4.6 細胞功效評估

• 動(dòng)物模型療效評估是臨床試驗的先決條件，理想動(dòng)物模型應再現患者病理病變和行為癥狀。小鼠和大鼠模型因易獲取和成本低常用于療效測試，非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物模型在神經(jīng)系統疾病研究中更具優(yōu)勢，更能準確預測人類(lèi)細胞劑量效應和療效。
• 應開(kāi)發(fā)和使用有效的行為評估方法和標準證明細胞產(chǎn)品功效，功能終點(diǎn)包括細胞支配、神經(jīng)回路重建等方面研究，有助于理解作用機制，鼓勵研究人員發(fā)表臨床前結果以進(jìn)行嚴格驗證，多項使用 hPSC 衍生神經(jīng)元細胞的臨床研究正在進(jìn)行。

5. 挑戰與未來(lái)前景

5.1 即用型冷凍保存格式

• 細胞冷凍保存的發(fā)展為細胞替代療法創(chuàng )造了條件，但有效細胞產(chǎn)品面臨配方開(kāi)發(fā)難題。當前多數冷凍產(chǎn)品輸注前需解凍后清洗、濃縮以去除 DMSO 等賦形劑，這一額外處理增加安全風(fēng)險，還可能損害細胞穩定性。
• 未來(lái)配方開(kāi)發(fā)的主要方向是研發(fā)含更少賦形劑、更簡(jiǎn)單（甚至不含 DMSO）的冷凍保存溶液，實(shí)現無(wú)需額外操作或僅簡(jiǎn)單稀釋的即用型神經(jīng)元細胞產(chǎn)品。甘油等其他冷凍保護劑可作為替代選擇，且地松鼠 iPSC 衍生神經(jīng)元獨特的抗寒途徑，為促進(jìn)神經(jīng)元細胞臨床應用帶來(lái)潛力。

5.2 功能檢測的替代標記

• 預測神經(jīng)成熟和體內結果是細胞置換面臨的挑戰。移植神經(jīng)元細胞成熟與整合耗時(shí)數月，功能評估需大量時(shí)間和動(dòng)物。
• 鑒定替代標志物能顯著(zhù)提升細胞質(zhì)量和研究效率，為產(chǎn)品效力測定及放行測試提供基礎。Parmar 團隊通過(guò) RNA-Seq 明確多巴胺能祖細胞基因表達與體內結果的關(guān)系，確定了相關(guān)標志物，推動(dòng)了該領(lǐng)域進(jìn)展。后續有望發(fā)現更多此類(lèi)生物標志物，但需投入驗證工作。

5.3 低免疫原性細胞產(chǎn)品

• 免疫排斥是細胞替代療法的關(guān)鍵問(wèn)題，多數試驗采用同種異體細胞產(chǎn)品，而神經(jīng)元細胞替代療法需植入細胞長(cháng)期存活。盡管中樞神經(jīng)系統有免疫特權，但同種異體細胞在大腦中的免疫排斥仍存在。
• 傳統克服方法是使用免疫抑制藥物，但其有副作用，會(huì )增加感染和腫瘤形成風(fēng)險，對老年患者（退行性疾病治療的關(guān)鍵人群）威脅更大。
• 生成通用相容細胞是可行途徑。一是通過(guò)基因編輯使 hPSC 的 HLA 沉默，該策略已在體外和體內證實(shí)可靠，但此類(lèi)工程通用神經(jīng)元細胞的應用尚未見(jiàn)報道；二是收集含多種 HLA 類(lèi)型或單倍型的 hPSC 系，已在非人類(lèi)靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物中驗證并在臨床研究中嘗試。不過(guò)這兩種方法各有利弊，臨床應用前需獲取細胞安全性和低免疫原性的有力證據。

總結來(lái)說(shuō)，hPSC衍生神經(jīng)細胞臨床研究雖進(jìn)展迅速，但面臨諸多挑戰，需深入研究以提升神經(jīng)細胞產(chǎn)品的安全性與有效性，尤其是關(guān)注潛在致瘤性和功能效力測定方面 。

參考資料：Sun Y, Feng L, Liang L, Stacey GN, Wang C, Wang Y, Hu B. Neuronal cell-based medicines from pluripotent stem cells: Development, production, and preclinical assessment. Stem Cells Transl Med. 2021 Nov;10 Suppl 2(Suppl 2):S31-S40. doi: 10.1002/sctm.20-0522. PMID: 34724724; PMCID: PMC8560198.

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